纲要
Calreticulin(CALR)体细胞渐变是骨髓增殖性肿瘤(MPNs)的紧要启动成分之一，是以开拓CALR渐变的靶向药物具备紧急意义。CALRN-聚糖连合机关域(GBD)的定点渐变可摧残渐变型CALR激活血小板生成素受体(MPL)的致癌效用。是以，靶向GBD的小分子或者会抵御渐变型CALR的致癌性。经过模仿挑选和实行考证，发觉苏木精对CALR渐变细胞的向导凋亡效用显著高于CALR野生型细胞。其它，CALR的敲除或C端截断可消除CALR渐变细胞的药物敏锐反响。咱们的钻研讲明，靶向CALR的GBD的小分子也许侵犯CALR-MPL互相效用并抵御致癌记号通路，进而筛选性地杀死CALR渐变细胞。
钻研结束
模仿分子连合实行判决了潜在的钙网卵白靶向化合物
参考已发布的野生型钙网卵白的球状机关特性，该卵白的固结素机关域囊括一个N-聚糖连合位点、一个ATP连合位点和一个钙连合位点(图1a)。进一步阐明了GBD在渐变型CALR致瘤功效中的紧急性(图1b)。咱们基于人类和小鼠钙网卵白的晶体机关生成了一个三维机关模子，并实行了两项自力的虚构分子连合钻研，以断定潜在的候选连合化合物(图1c)。
图1.钙网卵白GBD分子连合，找寻渐变型CALR抵御剂
判决筛选性升高CALR渐变细胞生机的化合物
在推断的前个候选化合物中，有41个可用于进一步钻研。经过CRISPR-Cas9技能挑选了8种高活性的化合物做后续钻研(图2a)。在这8个化合物中，咱们判决出苏木精具备渐变体稀奇性抵御效用。苏木通晓罕用于布局学染色，苏木精经过其羟基与CALRGBD上的四个氨基酸产生氢键(图2b)。与野生型CALR比拟，杂合型和纯合渐变型CALR的Ba/F3-MPL细胞系均对苏木精敏锐(图2c,d)。在共教育系统中，CALR-野生型和CALR渐变体Ba/F3-MPL细胞均被荧光标识。在苏木精存在时，教育7破晓CALR渐变细胞险些消逝，此时以CALR-野生型细胞为主；在不足苏木精(DMSO组)时，CALR渐变细胞成长渐渐超出了CALR-野生型细胞(图2e,f)。
图2.苏木精对CALR渐变细胞株的筛选性抵御效用
接下来，采纳CRISPR-Cas9技能敲除Ba/F3-MPL细胞系中的CALR，结束显示。CALR敲除和CRISPR-Cas9向导的CALRC结尾截断细胞均未产生苏木精敏锐反响(图3c,d)。
图3.CALR敲除和C-结尾截断均能抢救苏木精向导的CALR渐变细胞凋亡
苏木精与钙网卵白结兼并摧残CALR-MPL互相效用
渐变的CALR细胞对苏木精处置的敏锐反响是由GBD引发的(图4a,b)，且苏木精的筛选性依赖于MPL(图4c,d)。采纳NanoBRET探测苏木精与CALRdel52-MPL互相效用的潜在侵犯(图4e,f)。苏木精的参与以剂量依赖的方法节减了CALR-MPL的互相效用，讲明苏木精连合GBD阻断了MPL与渐变型CALR的连合(图4f)。随后在HEKT细胞系中刹时表白渐变型或野生型CALR，在细胞裂解液中别离增加苏木精和DMSO对比。与DMSO对比比拟，苏木素升高了渐变型和野生型CALR的降解温度，讲明苏木精与卵白之间的物理互相效用平稳了卵白的热变性(图4g)。野生型和渐变型CALR之间的连合不足筛选性是由于GBD在两种大局的卵白质中都存在。
图4.苏木精向导CALR渐变细胞凋亡并摧残CALR-MPL互相效用
苏木精节减CALR渐变型细胞的丰采并抵御STAT5磷酸化
real-timePCR结束显示，野生型和渐变型的CALRmRNA在药物诊疗后均略有增多(图5a)。而Westernblot解析显示，经药物处置后，在杂合子和纯合子CALR渐变细胞中，渐变CRAL的细胞因子和MPL均显著下调(图5b)。CALR渐变体的节减伴有着磷酸化的STAT5的节减和凋亡标识物PARP裂解片断的上调(图5c)。
图5.苏木精升高了CALR渐变体的胞内丰采，抵御了JAK-STAT记号通路
苏木精对CD34+细胞具备筛选性抵御效用
苏木精的处置节减了CALR渐变患者的集落产生单元（CFU）的数目，但在健壮对比或JAK2患者中没有(图6a)。均一化处置后，CALR患者的模范的细胞杀死率为40.5%，而健壮对比组为22.3%、JAK2患者为23.6%。这一结束讲明，苏木精在人原发CALR渐变的造血祖细胞中也存在肯定的抵御效用。
图6.苏木精抵御了CALR患者CD34+细胞的集落产生本事
议论
CALR渐变很大比例产生在JAK2阴性的ET和PMF患者，这些患者或者从基于CALR的靶向诊疗中获益。是以，找寻抵御渐变型CALR致瘤功效的化合物具备紧急的临床意义。钙网卵白是小分子抵御剂的新靶点，需求寻求一个有用的靶向机关域。既往钻研讲明渐变钙网卵白的GBD在其致癌功效的紧急性。在本钻研中，咱们寻求了CALR的GBD是一个潜在的诊疗靶向机关域。
本钻研表明苏木精是筛选性效用于渐变的CALR，经过NanoBRET探测药物处置后的这类互相效用，初度发觉一个小分子抵御剂苏木精也许摧残CALR-MPL互相效用，并进一步阐明了GBD对这类卵白的互相效用相当紧急。虽然苏木精可同时与野生型和渐变型CALR连合，但钙网卵白在造血细胞系中不是必须的，野生型CALR的细胞可本领受高剂量的苏木精。是以，咱们觉得CALR-野生型的药物效用或者不会产生严峻的*性。苏木精在CALR渐变体细胞中向导细胞去世的机制或者是由于渐变体细胞CALR-MPL互相效用的间断，细胞内渐变体细胞CALR卵白的耗尽以及抵御TPO非依赖性的JAK-STAT通路激活。
虽然苏木精在咱们的体外钻研中显示出了优良的功效，但它在医学上的运用尤其是在体内的行使或者有限制性。苏木精做为一种紧要用于布局染色的自然化合物，其药理性格仍需进一步测试。迄今为止，苏木素的临盆仅限于从原木中索取化合物，苏木素的合成和化学改性有待进一步钻研。
同业评议
苏木精的新效用：靶向CALR
JAK2和血小板生成素受体(MPL)的渐变曾经被断定为骨髓增殖性肿瘤（MPNs）的紧急启动因子，但它们并不能诠释总共模范的MPN病例。CALR渐变填补了这些疾病的病理生物学不够的部份，但它们在启动骨髓增生中的生物学效用并不明确。
CALR是一种内质网(ER)驻留卵白，具备多方面的生物学效用，囊括介导卵白质折叠和调动钙稳态。CALR具备固结素(聚糖连合)机关域，经过与新合成卵白上的聚糖互相效用，使其成为伴侣。在CALR编码区，MPN联系的插入或缺失致使+1bp的移码，变动了C端氨基酸序列。这使一个带负电荷的C端变为一个富含带正电荷的氨基酸的C端。这类移码也影响了内质网行使平常的折叠，CALR无奈维持在ER驻留并向细胞表面挪移。
这些卵白质序列的变动是怎么增进MPN产生的呢？渐变CALR在小鼠模子中的表白引发血小板加多，CALR渐变以MPL依赖的方法使细胞产生非细胞因子依赖性成长和变化。移码渐变变动了CALR的构象，使其固结素机关域与MPL产生了雄壮的互相效用。以二聚体的方法平稳了MPL，进而激活受体并加强下游记号传导和启动骨髓增生。
Jia等人聚焦于这类分子间的互相效用。他们哄骗CALR现有的晶体机关制做了一个聚糖连合域的模仿模子，并哄骗这个模子模仿分子连合钻研，以推断或者与聚糖连合域产生互相效用的药物。兴趣的是，此中一个已判决的分子苏木精，筛选性地抵御CALR渐变型BaF3细胞的成长。苏木精做为苏木精和伊红染色的染料咱们对它很熟习，当用做染料时，苏木精进一步被氧化并与金属络合。在这些钻研中行使的苏木精是未经妆点的大局，他们发觉与苏木精同属一类的其余化合物(儿茶酚)也对CALR渐变细胞呈现出筛选性，虽然没有一种比苏木精功效更好。
在共教育模子中，苏木精能向导CALR渐变细胞的凋亡，而CALR野生型细胞不受影响。为了评价苏木精的这些影响是不是切实是由于与CALR聚糖连合域的互相效用致使的，做家对该机关域的关键残基做了代替，这些聚糖连合域的渐变抵御了苏木精的效用。结尾，他们发觉苏木精升高了人CALR渐变型白血病模范的集落产生的潜力。
在分子水准上，Jia等人哄骗生物发光共振能量变化实行阐明了苏木精抵御渐变体CALR与MPL的互相效用。这与苏木精和固结素连合的道理是一致的，紧要摧残了它与MPL的聚糖互相效用的本事。其它，这类互相效用抵御了MPL下游STAT5的激活。综上所述，这些数据讲明，与CALR固结素机关域连合的小分子也许禁止它与MPL互相效用，进而禁止反常的MPL激活。
聚糖在生物学中经常被低估，但虽然如许，它们产生了膜卵白机关的紧急构成部份。聚糖决意膜卵白的折叠、平常机关的产生，并介导与其余分子的互相效用。MPL和CALR渐变的互相效用再次强调了聚糖及其互相效用的固结素的紧急性。固结素曾被用于诊疗粒细胞恶性肿瘤，吉妥珠单抗ozogamicin是一种针对急性髓系白血病开拓的药物，以唾液酸连合固结素CD33为靶点。但是，调动糖-卵白互相效用以升高诊疗功效的关键下一步对象是怎么摧残固结素与靶方向稀奇性连合。
本钻研为钙网卵白聚糖连合域的靶向性供给了一个紧急的凭据。苏木精具备微摩尔效劳沙门不了解的体内耐受性，它自己很或者成为下一步药物开拓的开始。
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