江西白癜风QQ交流群 http://liangssw.com/bozhu/12953.html冰冻切片（frozensection）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。组织经固定或不固定均可进行冰冻切片。
操作步骤：
1.组织取材
2.组织处理
不需固定的组织可以直接进行后续操作。
对于需要固定的组织：4%多聚甲醛固定1-2小时，PBS洗涤，蔗糖溶液沉降过夜。
3.组织包埋
目前科研中常用OCT包埋剂进行组织包埋。OCT是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。
在合适模具（如锡纸折成的小盒）中倒入一层OCT，覆盖住底部，将组织取出放入模具，继续加OCT直到完全淹没组织，防止组织上浮，避免产生气泡。之后在液氮或冰冻切片机内进行速冻，制成冻块后放入冷冻切片机切片。
4.切片
1)将冻好的组织块固定在样品托上。切片时，温度以-15℃~-20℃为宜，根据不同的组织特性可以进行调节。如果温度太低，片子容易卷曲和破碎；如果温度太高，片子就会皱成一堆。
2)调整好刀片和组织块的方向，使其垂直。刀片的锋利性很重要，当片子质量下降时最好立即更换刀片。
3)先切掉表面的包埋剂，直至待取组织露出后调整好片子厚度开始正式切片。切片厚度根据不同的组织和实验目的而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切。
4)正式切片前要调整好防卷板。准确地将防卷板调至适当的位置，以保证切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀与防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。
5)正式切片获取的目的组织片用刷子小心转移至玻璃载玻片上，并铺平整，使其牢牢粘附。可选取不同位置和区域进行连续切片。
5.染色封片
含有切片的载玻片放入相应的固定液固定后，PBS进行洗涤。之后按照相应的染色需求进行染色。最后通过淬灭封片剂用盖玻片封片，注意不得有气泡。
对于脂肪的观察，应该首选油红O染色，对于脂肪组织，所选固定液以甲醛固定效果最为理想，常用中性甲醛固定液，但应该注意的是，应避免使用含有有机溶剂（如乙醇）的固定液，以避免固定液中的有机溶剂对组织内脂肪的溶解，此外，含汞固定剂也应避免，昇汞可使组织变硬，导致切片困难。油红O属于偶氮染料，极易溶解于脂类物质内，染色液为由异丙醇和水配制成的油红O乳化液，染色时，组织切片内的脂肪吸取染色液的油红O，使脂肪具有了染料的颜色—红色，从而对细胞内的脂肪滴进行定性和定位。
冰冻切片，厚度为10-15um，常温干燥15-20min。异丙醇浸洗3-5分钟，避免把水带入油红O，油红O染液10分钟，60%异丙醇溶液洗3分钟，再蒸馏水洗，苏木素复染细胞核5分钟，分化返蓝，封片剂封片。
结果:脂肪滴呈红色或者橘红色，细胞核呈淡蓝色。
注：
1、由于脂肪易溶于有机溶剂，所以一般采用冰冻切片染色来显示。
2、脂肪染色的冰冻切片不宜太薄，切片厚8-10μm，过薄的切片常会使脂质丢失。
3、染色结果不能长期保存，应尽快观察。
4、油红O染色常用作染脂肪，脂类染色法最常用以证明脂肪变性，脂肪栓子以及肿瘤的鉴别。脂类染色使用最广泛的染料是苏丹染料，最常用的有苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，苏丹黑及油红O等。脂肪被染色，实际上是苏丹染料被脂肪溶解吸附而呈现染料的颜色。
5、油红O储备液：油红O0.5g溶于%异丙醇ml，4℃避光密闭保存。
油红O工作液：实验前，将储备液与蒸馏水6:4比例稀释，并过滤，现配现用。
6、苏木精复染的时间不宜过长，控制在1min以内。
7、水性封片剂封固（甘油明胶），不能用中性树胶封固。
8、60%异丙醇分化，应于镜下控制至脂肪组织呈鲜红色，间质无色为度。
9、封片时，发现气泡，不能压盖玻片驱赶以免脂滴移位。
Erica
