北京医院皮肤病治疗 https://m-mip.39.net/nk/mipso_6172010.html免疫组织化学（IHC）是许多实验室的主要免疫测定方法，用于证明重要蛋白质的存在与否，检测翻译后修饰，诊断疾病等等。IHC使用免疫学和生化技术，通过与目标抗原相互作用的标记抗体来检查不同的组织切片。可见标记或染色剂用于可视化抗体抗原相互作用。IHC可以可视化细胞的独特细胞成分，广泛被病理学家和诊断人员使用。
实验前
1、样品制备
在室温下，用2%多聚甲醛将新鲜解剖的组织(3mm厚)1小时或过夜固定。
用流动的自来水冲洗组织5分钟。
用70％，80％，95％的酒精分别使组织脱水，每次5分钟，然后用％的酒精3次脱水，每次5分钟。
用二甲苯清洗组织2次，每次5分钟。
将组织浸泡在石蜡中3次，每次5分钟。
将组织包埋在石蜡块中(可以在室温下保存多年)。
在切片机上将石蜡包埋的组织块切成5-8μm的厚度，并漂浮在含有蒸馏水的40°C水浴中。
将切片转移到适合免疫组织化学的载玻片上。
切片后65℃，烘干6小时。
上午
2、脱蜡与水化
将玻片在二甲苯中脱蜡2次，每次10分钟。
将玻片转移到无水乙醇中2次，每次5分钟，然后分别通过95％，85％酒精一次，每次3分钟。
用自来水冲洗玻片2次，洗掉酒精。
3、抗原修复
我们一般有使用两种修复方法，常以碱性TrisEDTA修复液为主，如果效果不好会换成酸性的。
1XTrisEDTA修复液PH8.0
TrisBase1.21gEDTA0.37gddH2O定容至1LHcl调整PH8.0
1X1M柠檬酸缓冲液PH6.0
柠檬酸钠3g柠檬酸0.4gddH2O定容至1L。
将ml抗原修复液倒入染色容器中微波先将修复液加热15min，然后加入载玻片，中火微波15min，冷却至室温1h，可放在冰袋附近，但不可降温太快，防止载玻片破裂。(抗原修复液：cat#CPL,CBB(PH=6)cat#ETA、TES(PH＞6)cat#PSS（胃蛋白酶）cat#TSS（胰蛋白酶））
下午
4、阻断
使用免疫组化笔，把待染色组织圈起来，以节约试剂使用。(免疫组化笔：cat#KPM)然后使用3%H2O2室温孵育12min后，自来水洗，暂时浸泡在PBS中。(过氧化氢封闭液：cat#ACA)
5、封闭
使用ddH2O配置的5%羊血清37℃条件下孵30min后，将羊血清倒干净即可。（通用型封闭液：cat#AAA）
6、抗体孵育
一抗：将μl适当稀释的一抗（在抗体稀释缓冲液中，例如含有0.5％BSA的PBS）涂在玻片上的组织切片上，37℃孵育1h后。PBST（PBS+1%吐温20）洗3次。（一抗稀释液：cat#APG,ATG（绿色）cat#ABB，ADT（无色）
二抗：2滴/片37℃孵育30min,PBST洗3次。（多价二抗
#ABN,反应种属:小鼠，大鼠，兔，豚鼠；通用型二抗稳定剂cat#SZ03)
注：如果用的是生物素标记的二抗，应当加一步链霉亲和素偶联的HRP复合物37℃孵育15min。
7、显色DAB
AB液：50μl色原+1ml底物。现配现用，7min内观察，有明显的组织显现就立即终止(PBS)，7min后还是不显色说明该组织不会显色，需终止反应。自来水冲洗3遍。底物#ACV(DAB)cat#PRD(PermanentRed）cat#FRT(Fast-Red）
8、复染
使用过的苏木素再次使用前要先捞出液体表面的一层氧化膜，然后染色90s，自来水冲洗3次。
9、分化
75%乙醇+1%Hcl分化1s后，自来水冲洗3次。
注：目的是通过调整PH分化细胞膜和细胞质。
10、脱水
通过4次（85％2min，95％2min，％2min和％2min）的酒精使组织玻片脱水后，冷风将载玻片吹干。（吹风机：
