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言
免疫组化（IHC）实验是进行定位、定性及相对定量的研究的实验方法。但在组织芯片上进行过程中，经常会遇到一些问题：组织脱片、封片后有气泡、非特异性背景等等。。。今天和大家分享下免疫组化实验的注意事项及建议，都是满满的干货哦！
01
实验步骤
1、脱蜡前60℃烤片30分钟-60分钟；
2、根据每一种抗体的要求，对组织抗原选择合适的修复方式（骨、骨肉瘤及软骨肉瘤修复过程中尽量平放片子进行修复，且动作轻柔，以免物理震荡导致的脱片）
3、用3％H-甲醇封闭内源性过氧化物酶，室温10分钟，PBS洗5分钟×3次；
4、滴加正常非免疫动物血清，室温10分钟；
5、除去血清，滴加一抗（即用型/浓缩型,选择合适浓度），4℃冰箱过夜；
6、用0.1%Tween-20PBS洗5分钟×3次；
7、滴加二抗（生物素标记的羊抗鼠/兔IgG），室温孵育10分钟；
8、用0.1%Tween-20PBS洗5分钟×3次；
9、滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温孵育10分钟；
10、DAB\AEC显色时间在显微镜下控制，蒸馏水洗终止显色；
11、苏木素复染、水洗、分化后充分水洗，常规脱水透明，中性树胶封片。
免疫组化结果
02
实验过程中以下几点应明确和注意：
1、试剂盒选择的建议：
a、明确所选试剂盒的原理、特点；
b、再根据所选组织芯片的类型选用实验方法。
2、保证抗原质量的建议
a、标准的样本固定、处理方式；
b、严格烤片温度及时间；
c、依据一抗要求，选择合适的修复方式，标准的修复操作过程。
3、消除或减弱非特异性背景的建议：
a、脱蜡彻底；
b、严格洗涤时间和次数，洗涤除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色；
c、优化选择合适的一抗稀释度；
d、血清蛋白封闭应充分；
e、确保孵育盒\湿盒平衡，保证实验反应的水平一致性。
f、显色时间显微镜下控制。
4、验证操作流程的建议：
a、载玻片必须防脱玻片捞片；
b、严格烤片温度和时间；严格抗原热修复的液体温度、时间的把控，不能在修复后让温度骤降；
c、应轻柔振摇洗涤，避免洗涤力度过猛。
5、实验对照设定不能遗漏：对照设定用来评定实验系统的正确性，设为阳性对照，用已知抗原阳性的切片与检测样本同时实验，阳性对照应呈阳性结果；阴性对照，用不含已知抗原的样本做对照或空白对照，实验结果为阴性，用以排除假阳性结果。
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